植物源農藥研究進展

    在中國，由於化學農（nóng）藥（yào）的濫（làn）用導致（zhì）40種以（yǐ）上的（de）主要（yào）農（nóng）作物的病原微生物和害蟲產生抗藥性、生態環境惡化、生物多樣（yàng）性水（shuǐ）平（píng）降低等一係列（liè）問題，而且傳統化學農藥往往含有對人畜有害的成分，以植物體內對病原菌具有拮抗性的化學物質為（wéi）主（zhǔ）要成分的（de）植（zhí）物源農藥，因（yīn）其具（jù）有低（dī）毒、低殘留、對非靶標生物及環境（jìng）安全的特點而越來越（yuè）受到重視。據（jù）研究，常（cháng）用植物源農藥有生物堿類化合物（wù）、黃（huáng）酮類化合物、萜類化合物、揮發油等，不同類型的化合物具有不同的骨架結構，根（gēn）據化合物特性的的不（bú）同，選擇不同方式進行提（tí）取（qǔ），不同的化（huà）合物也（yě）具有不同的抑菌及提高植物抗氧化力等生理特性。本文綜述了植物源農（nóng）藥中常（cháng）見活性（xìng）成分的結構表征、提（tí）取方式及其抑菌研究進展，旨為植物（wù）源農藥的開發提供技術支撐。
一（yī）、植物源農藥常用的活性提取物

1.生物堿類化合（hé）物（wù）
 
    目前已發（fā）現的（de）21,000多種生物堿類化（huà）合物，多分布在茄（qié）科植物的（de）種、果、花、莖等植物部位。生物（wù）堿類化合物大多為環狀結構，氮素被包含在碳環內。在抑菌時C1、C2、C9和C10中的羥基作為取代（dài）基會出現結構取（qǔ）代的情（qíng）況。生物堿常（cháng）見類型有異（yì）喹啉（lín）類生物堿（jiǎn）、喹啉類生物堿、吲哚類生物堿、呱啶類生物堿等，其中N-甲（jiǎ）基四氫原小檗（bò）堿、原小檗堿和苯胺類（lèi）生物堿的C2和C3的4階碳（tàn）和亞甲二氧基在提高N-甲基四氫（qīng）原小檗（bò）堿的抗病毒、抗菌和抗真菌活性方（fāng）麵起著重要作用。當進行生物堿類（lèi）化合物的結（jié）構（gòu）優化時，可重點優化生物堿的C2和C3的4階碳和亞甲二（èr）氧基，從而提高該類型化合物的抑菌效果。
 
2.黃酮類化合物
 
    黃酮類化合物目前已發現800餘種，屬於植物的次生代謝物質。黃酮類的化學結構類型較多，一般以C6-C3-C6的形式為基礎。黃酮類化合物（wù）是苯並-γ-pyrone衍生物，當病菌對（duì）其進行侵染時，它會根據其側（cè）組位置和換位進行分類；其藥理作用主要是根（gēn）據它的結（jié）構類別、羥基化（huà）程度、其他取代和共（gòng）軛以及聚（jù）合程度相互協同合作，其中類黃酮（tóng）在生物係統中保護作用歸因（yīn）於它們傳遞氫或電子自由基的能力；而芳（fāng）香環上特殊（shū）位置的羥基能夠提高抑菌作用（yòng）。在進行黃酮（tóng）類化合物的結構優化時，可先尋找到該物質芳香環的羥基，調整其位置，再查看該羥基在新位置上與它的結構類別、其他（tā）取代和共軛以及聚合程度互相協作的（de）效果（guǒ），從而達到整體提高黃酮類化合物的抑菌效果。

3.萜類（lèi）化合（hé）物
 
    在天（tiān）然產物中，萜類（lèi）化合物是結（jié）構 多、結構 大的化合物之一，目前已發現50,000多種。萜類（lèi）化合物可根據異戊二烯（xī）進行分類，即將不同碳（tàn）數量及組成結構進行線性排列，形成多個異（yì）戊二烯（xī）單（dān）元組成的（de）頭尾相連的異戊二烯聚合體，少部分萜類化合物也會以各種含氧（yǎng）衍生物的形式存在。萜類化合物主要由甲羥戊酸途徑生成，但（dàn）也可能來（lái）源於2-C-甲基-D-赤蘚糖醇4-磷酸，而缺少吡喃環時，則一般被認為沒有活性，不具備抑菌作用。在進行萜類化合物的結構優化時，可以吡喃環為切（qiē）入點進（jìn）行研究，來提高萜類化合物的抑菌效果。

4.揮發油
   
    揮發（fā）油又稱植物（wù）精（jīng）油，主要來自芳（fāng）香植（zhí）物，是脂溶性的天然化合物。植物精油成分複雜，按化學結構分為芳香族、脂肪族和萜類，其中以萜類成分為主，主要包括單帖、倍半萜以及醇類、酚類、醚類、醛、酮、羧酸和酯等含氧衍生物。揮發油的活性可能是由某些小化合物如香芹酮的存在所致。揮發油所含成分太多，可推測出抑菌作（zuò）用主（zhǔ）要源於它的組成成分的協同（tóng）作用，並非一種物質的作（zuò）用。進行結構優化太過複雜。
 
二、活性物質提取方式
 
    植（zhí）物會通（tōng）過自身的代謝功能合成不同的化學（xué）物質以及衍生物，這些物質具有抑菌、抗病、抗氧化等作用。因此可以（yǐ）根據不同成分的特（tè）性選擇合適提取方式（shì）進行成分提取。
 
1.生物堿類化合物
 
    在提（tí）取生物堿時，生物堿的溶解性能是提取方式選擇依據，因（yīn）此根據不同生物堿在不同溶劑中的（de）溶解度進行溶劑選擇，在進行親水性生物堿的提取時要注意（yì）溶劑酸堿度的調節。Wei等將白屈菜粉碎後超聲波提取，固液比（bǐ）為1∶8，提取液為75%乙（yǐ）醇，85%超聲頻率提取35 min得到白屈菜紅堿；白屈菜紅堿濃度為1.7×10^-6mg/mL時，抑菌活（huó）性 高，對（duì）番茄枯萎病菌Z0413、黃瓜枯（kū）萎病（bìng）菌Z0418等具有使用量少、抑菌性強的特點。Han等將延（yán）胡索粉碎後用正乙烷、乙酸乙酯、氯仿浸提分餾，純化後得到3種異喹啉（lín）生物堿脫氫木犀草堿（jiǎn）、針刺堿和蟲草堿，3種堿對（duì）小麥葉鏽病菌、花椒炭疽病菌均有一定的抑製（zhì）作用，研究發現C-13和（hé）季銨鹽中（zhōng）甲基的缺失氮原子在抗真菌藥物中起著重要作用。陳偉等依次使用乙酸、氨水、正（zhèng）丁醇和甲醇對馬鈴薯薯芽與薯皮進行粉碎萃取，不（bú）斷調節溶劑酸堿度， 後得到馬鈴薯糖苷生（shēng）物堿；隨著（zhe）濃度增大，馬鈴（líng）薯糖苷生物（wù）堿對枸杞（qǐ）致腐病原菌鐮孢（bāo）菌的抑製作用隨（suí）之增強，但濃度不能高（gāo）於0.15 g/mL。周兵（bīng）等按照醇-酸水-有機溶劑提取（95%乙醇回流提（tí）取2 h後，依次（cì）用酸性水溶（róng）液和（hé）濃氨水進行酸堿處理， 後用氯仿萃取）法對碎米莎草莖進行總生（shēng）物堿提取；隨著濃度（dù）的增加，總生物堿（jiǎn）對水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、番茄早疫病菌和楊（yáng）樹潰瘍病菌的抑製作用隨之增加，但（dàn）對水稻苗（miáo）高（gāo）有嚴重（chóng）抑製作用。
因此，在提取生物堿時（shí），不光要根據溶劑極性來提取對應的生物堿類化合物，還要在提取（qǔ）過程中不斷調節溶劑的酸堿度。不同類型的（de）生物堿對不同的植（zhí）物病害有一定的抑製作用，總生物堿類化合物（wù）不能用於水稻田，會影響水稻幼苗的生（shēng）長（zhǎng）。

2.黃酮類化合物
 
    黃酮（tóng）類化合物提取的關鍵在於所提（tí）取的（de）黃酮類物質是（shì）遊離苷元還（hái）是苷類化合物，不同的化合物使用極性不同的溶劑，極性越大的溶劑所提取（qǔ）的極性化合物含量會越多，不同極性的溶劑混合提取會出（chū）現協同作用。Bartmańska等使用不同極性的溶劑分別從廢除的啤酒花殘渣中浸提得到7種黃酮類化合物，其中2種為天然黃酮（α,β-二羥基胡蘿卜素和8-丙基（jī）柚皮素），提取黃腐醇含量 多的溶劑是甲醇＋二氯（lǜ）甲烷；丙酮、乙酸乙酯、甲醇的粗提物對鐮刀菌的（de）抑製所差無（wú）幾，而亞甲基氯化物則對（duì）灰黴病菌有較強的抑製作用。EL-Hefny等使（shǐ）用乙酸（suān）乙酯和甲醇分別對大黃的根部進行萃取，分餾分離（lí）後物質用蒸（zhēng）餾水配製成含有黃酮-3-醇（chún）和二苯乙烯的藥液，並對田間感染稻瘟菌的小麥進行抑菌試驗（yàn）；結果顯示，其（qí）能顯著抑製病菌孢子的萌發。

3.萜類化合物
 
    萜類化合（hé）物常用的提取方式為壓榨法、水（shuǐ）蒸氣（qì）蒸餾法、脂浸潤法、超靈（líng）界流體萃取法和溶劑提取法。前4種方法可用於提取精油，一般萜類提取都（dōu）是根（gēn）據提取物質的苷元形式選擇（zé）不同極性、不同沸點的（de）溶（róng）劑。Oludemi等將靈芝（zhī） 行乙醇回流提取，幹燥後（hòu）按照提取時間78.9 min、提取溫度90℃、溶劑62.5%乙醇進行熱萃取，得（dé）到提取率為（4.9±0.6）%，含量為（435.6±21.1）mg/g的三萜。Popov等研究發現，乙酸乙酯提取白樺（huà）醇的純（chún）度比95%乙醇提（tí）取的白樺醇純（chún）度（dù）高，並且可以在乙酸乙酯提取完白樺（huà）醇之後，使用水蒸（zhēng）餾法將（jiāng）提取殘渣中的乙酸乙酯回收，形成綠色萃取。Qun等通過使用蒸餾水，保證1∶55 （g/mL）的固液比，在超聲波-微波輻照功率90Ｗ，提取周期（qī）75 s的條件下對角果進行三萜類化合物提取，得到16.789 mg/g，與預期（qī）相符。

4.揮發油
 
    揮發油 常見的成分就是單帖及倍半萜（tiē），因此提取精油時常用水蒸氣法和超臨界流體萃取法（fǎ）。Bammou等通過水（shuǐ）精蒸（zhēng）餾裝置對蚤（zǎo）草屬進行水蒸氣蒸餾，提取精油對尖孢鐮刀菌有（yǒu）一定的抗性。Shukla等使用超臨界CO₂對（duì）幹薑進（jìn）行（háng）多分離器在線分餾，CO₂回收率為96.15%。工業生產中的（de）工藝優化（huà）及其驗證標度單位表明，超臨界CO₂萃取和同步（bù）萃取分餾可用於一係列天然生物活性化合物（wù），如維生（shēng）素（sù）、必需脂肪酸。Agha等采用二維氣相色譜法和簡易氣相色譜法對天竺葵提取揮發油的化學成分進行檢測，揮發油的主要成（chéng）分是香茅醇、香葉醇和芳樟（zhāng）醇。揮發（fā）油（yóu）也多用於果蔬保鮮及美妝（zhuāng）行業中，所以使用超臨界（jiè）CO₂作為萃取劑，既（jì）價格低（dī）廉，又無（wú）殘留，且不破壞化合物結構。在提取各類化合物時，除了（le）根據不同提取物質選擇不同極性的溶劑外，可以采用微波（bō）輔助提取或超聲波輔助提取方式。對（duì）比傳統的溶劑提取法，通過超聲或微波產生切（qiē）向力，使（shǐ）溶劑滲入，加速有效成（chéng）分進入提取溶劑中，從而提高提取率，且不降低（dī）提（tí）取物的活（huó）性。郭孝（xiào）武分別使用超聲波輔助提取法、回（huí）流提取法、浸提法對益母草的總生物堿進行提取（qǔ），發現（xiàn）超聲波輔助提（tí）取法的提取率較其他（tā）2種方法要（yào）高，且未改（gǎi）變提取物的化學結構（gòu）。
 
三、活性（xìng）物質抑菌機製

1.生物堿類化合物
 
    生物堿類化合（hé）物可以在需要保護（hù）的（de）細胞上形成一層保護膜，從而減少（shǎo）其他病菌對細胞的破壞。Zhao等使用異（yì）喹啉生物堿對稻瘟病菌進行（háng）抑製試驗，結果表明，菌絲（sī）體彎曲、崩解，細胞膜完（wán）整性（xìng）受損，同時還抑製菌絲的活性氧生（shēng）成，破壞了菌絲（sī）的膜功（gōng）能和細胞增殖。
對於病菌抑製，生物堿類化合物可對病菌細胞基因及酶類進行（háng）影響，或者對細胞膜、菌絲生長形態造成影響，從而達到抗病的作用。

2.黃酮類化合物
 
    黃酮類化合物的抗病性（xìng）可能是非特異性（xìng）的，通過黃酮類化合物的抗氧化性，使致病菌因缺氧（yǎng）而失去活性，影（yǐng）響生物膜（mó）的形成、膜的通透性等（děng）生理特性（xìng），影響某些酶（méi）對細胞質的抑製。Rachmawaty等對（duì）幹燥的可可果進行粉碎後使用7∶3的丙酮水溶液浸提3次，得到黃酮類化合物（wù），發現其對尖孢菌的孢子有（yǒu）強烈的抑製作（zuò）用。Chen等研究發現黃芩素在32和64μg/mL時對病（bìng）菌具有下調群體感（gǎn）應係統調節因（yīn）子及基因細胞間粘附（fù）素在生物膜中的表達生產細胞的能力。
 
3.萜類化合（hé）物
 
    萜類（lèi）化合物對真菌的抑（yì）製作用主（zhǔ）要表（biǎo）現在對真菌菌絲的生長抑製，使（shǐ）其尖端膨脹、分支形成孢子梗（gěng）或使菌絲斷裂，對（duì）細胞造成破壞以及對（duì）真菌細胞蛋白的下調。楊婷等對13種萜類化合物進行抑菌篩選，其中，香芹酚、丁香酚、異丁香酚、枯茗醛、百裏（lǐ）香酚對孢炭疽菌的 佳抑製濃度為50μg/mL。Alexa等對丹參和百裏（lǐ）香分別進行萃取，得（dé）到γ-鬆油烯和ｐ-百裏香酚，兩者（zhě）混合對禾穀鐮刀菌有一定的抑製協（xié）同作用。丁（dīng）蘭等從香茶菜屬中分離（lí）出4種萜類物質（leukamein E、weisiensin B、熊果（guǒ）酸和（hé）2-α-羥基熊果酸），並考察（chá）幾種物（wù）質對（duì）蝴蝶（dié）蘭莖（jīng）腐病中分離出的鐮孢屬真菌的（de）抑製活性；發（fā）現真菌的菌絲簡短膨大成為囊泡，出現斷（duàn）裂，逐漸變為空泡；菌絲體細胞膜（mó）結構被嚴重破壞，且大大改變了其通透性。


4.揮發油
 
    揮發油是通過精油（yóu）及其組分對細胞膜造成破壞，增（zēng）大膜（mó）的通透性，致使細胞內的物質泄漏，或直接破壞病菌的酶係統（tǒng），致（zhì）其死亡。Moghaddam等發現從山羊草種子中提取的精油對青枯病菌（jun1）有較強（qiáng）的抑製活性，能夠（gòu）顯著抑（yì）製菌絲的生長（zhǎng）。Yu等考察從茶樹（shù）中提取的精油對灰黴病菌的抑製活性，研究發現精油中的α-鬆油醇、1,8-桉葉（yè）素混合後（hòu）能穿透病菌細胞，破壞細胞器而不影響細胞（bāo）膜透（tòu）性。相比之下，鬆油烯破壞了膜的完（wán）整性，增加了膜的（de）通透性（xìng），導致離子滲漏和膜功能障礙。
 
四、展望
 
    目前研（yán）究（jiū）人員對各類（lèi）植物源（yuán）化合物已有一定的研究，但不（bú）同類型化合物的生物功能和生態化學功能尚未被充分研究，例如化合物在植物體內代（dài）謝過程、所具有的功能，以及在（zài）生態環境中的存在形式與歸宿途徑等。
 
    在提取工藝中，不僅要考慮優化工藝增加物（wù）質提取率或提取（qǔ）出其他物質類型，還要考慮提取成（chéng）本，以及商業生產的經濟性，是否適用於工廠（chǎng）批量化生產。例如將許多高質量的有價值的化合物被一個（gè）單一的（de）步驟回收，從某種低廉的（de）植物中得到大量高質量的化合物等。對於植（zhí）物源農藥，所需化合物的活性（xìng）篩選仍然是新農藥開發的關鍵步（bù）驟，具（jù）有（yǒu）較高活性（xìng）的化合物可以直接（jiē）開發為新藥。化合物的結構對於抑菌活（huó）性有著重要影響，因此可以將“組學”技術與分子網絡藥（yào）理（lǐ）學（xué）相結合，在原物質結構的基礎上進行結構修飾（shì），合成具有高效抑菌能力的新物質。
 
來源：《黑龍江（jiāng）農業科學》2021年第7期
作者（zhě）：淮陰工學（xué）院（yuàn）生命科學與食品工程（chéng）學院  於忻瀅  張國良（liáng）  範鬆（sōng）  黃誌煒  張葉（yè）